Phương pháp xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn Endotoxin

Bài viết bởi ThS. Nguyễn Đắc Tú, Trưởng nhóm Đánh giá Chất lượng Sản phẩm Trung tâm Công Nghệ Cao và ThS. Nguyễn Thị Mai, Chuyên viên xét nghiệm nội độc tố vi khuẩn, Trung tâm Công Nghệ Cao

Với sự phát triển ồ ạt gần đây của các trung tâm ứng dụng liệu pháp tế bào, không ít cơ sở không đáp ứng được việc tuân thủ quy trình kiểm soát chất lượng sản phẩm, trong đó có tiêu chuẩn về nội độc tố. Điều này sẽ tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với khách hàng sử dụng dịch vụ y tế tại những cơ sở này.

Theo quy định của các tiêu chuẩn quốc tế về trị liệu tế bào như ISCT, FACT, AABB, xét nghiệm xác định nội độc tố được xếp vào danh mục bắt buộc cần kiểm tra cho các sản phẩm tế bào trước khi sử dụng cho bệnh nhân. Để có thể đảm bảo được sự an toàn cao nhất cho khách hàng theo các tiêu chuẩn quốc tế, Trung tâm Công nghệ Cao, Bệnh viện Vinmec Times City đã xây dựng và thực hiện xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn cho các sản phẩm tế bào gốc và tế bào miễn dịch dựa trên phương pháp được FDA Hoa Kỳ cấp phép.

1.Phép thử nội độc tố vi khuẩn

Phép thử nội độc tố vi khuẩn dùng để phát hiện hoặc định lượng nội độc tố của vi khuẩn có trong mẫu thử cần kiểm tra. Phương pháp sử dụng thuốc thử lysate là dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu loài sam biển, Limulus polyphemus hoặc Tachypleus tridentatus. Hiện nay có 3 phương pháp để thực hiện xét nghiệm:

• Phương pháp tạo gel dựa trên sự tạo thành gel. Khi bổ sung mẫu cần kiểm tra vào ống có chứa sẵn thuốc thử, sẽ tạo thành gel khi có mặt nội độc tố.
• Phương pháp đo độ đục, dựa vào sự thay đổi độ đục của thuốc thử lysat khi tạo gel.
• Phương pháp đo màu động học dựa trên sự thay đổi màu của phức hợp màu- peptid.

Tùy theo điều kiện kèm theo của mỗi phòng xét nghiệm và đặc thù của mẫu thử, sẽ vận dụng một trong những kỹ thuật thích hợp để triển khai phép thử và phép thử sử dụng thiết bị và dụng cụ cho xét nghiệm phải không lấy phí endotoxin. Khi có hoài nghi hoặc tranh chấp, Kết luận ở đầu cuối sẽ dựa vào giải pháp tạo gel trừ khi có hướng dẫn khác .

2. Phương pháp tạo gel

Đây là giải pháp được cho phép phát hiện hoặc xác định lượng nội độc tố trên sự tạo gel của thuốc thử lysate khi xuất hiện nội độc tố. Sử dụng một protein gây đông máu có trong loài sam biển. loại protein này được hoạt hóa khi xuất hiện nội độc tố. Phản ứng tạo gel gồm có một loạt những bước kích hoạt enzyme trong Limulus Amebocyte Lysate. Xét nghiệm được triển khai bởi thêm 0.1 mL mẫu thử vào trong ống xét nghiệm đã sẵn sàng chuẩn bị sẵn 0.1 mL dung dịch thuốc thử LAL. Hỗn hợp này được trộn đều và ủ tại 37 oC trong 60 phút. Đọc tác dụng sau thời hạn ủ này, phản ứng dương thế nếu gel tạo thành không bị chảy ra khi nhẹ nhàng dốc ngược ống nghiệm ( 180 o ), phản ứng âm tính khi không tạo thành gel hoặc gel không đủ chắc. Hạn chế của chiêu thức gel-clot là thời hạn xét nghiệm dài và thao tác chuẩn bị sẵn sàng nhiều, sai sót do thao tác khá cao. Chỉ cho tác dụng định tính. Không xác lập được nồng độ đúng chuẩn trong mẫu thử .

3. Phương pháp đo độ đục

Còn gọi phép thử bán định lượng. Phương pháp đo độ đục tựa như như giải pháp sinh màu động học về giải pháp và cách thống kê giám sát lượng nội độc tố có trong mẫu xét nghiệm. Phép thử này xác định lượng nội độc tố có trong mẫu thử bằng cách triển khai phản ứng tiến dần tới điểm dừng trong quy trình tạo gel. Là giải pháp trung gian giữa giải pháp tạo gel và so màu động học ngoại trừ bước sau cuối. Các bước tương quan đến phân tách của một protein gây đông trải qua enzyme gây động được hoạt hóa. Sản phẩm phân tách phối hợp với nhau như tác dụng của tương tác ion xảy ra sau khi phân tách, hỗn hợp phản ứng trở nên đục. Phương pháp đo độ đục xác lập nồng độ nội độc tố theo 2 cách : động học và điểm cuối. cả 2 giải pháp đều nhu yếu kiến thiết xây dựng đường cong chuẩn. Nồng độ nội độc tố trong mẫu được xác lập bằng cách đo tỷ lệ quang so với đường cong chuẩn, khoảng chừng thời hạn cho đến khi đạt được mức độ đục của nồng độ thấp nhất của đường cong chuẩn .

4. Phương pháp đo màu

Còn gọi là so màu động học. Phương pháp được phát triển dựa trên 2 phương pháp tạo gel và đo độ đục trong năm 1977. Nội độc tố trong mẫu thử được xác định dựa trên chất màu được giải phóng ra từ một cơ chất mang màu là kết quả của phản ứng giữa nội độc tố với thuốc thử lysate. Có 2 kỹ thuật đo: đo màu tại điểm dừng và đo màu động học. Đo màu động học dựa trên mối tương quan giữa nồng độ và thời gian để hỗn hợp phản ứng đạt tới độ hấp thụ. Phương pháp này cũng cần xây dựng đường cong chuẩn, để xây dựng đường cong cần tối thiểu 3 nồng độ. Nồng độ nội độc tố trong mẫu thử được so màu với đường cong chuẩn. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay bởi tính tiện lợi và độ nhạy cao của phương pháp.

5. Một số điểm cần lưu ý trong xét nghiệm xác định nội độc tố

Phép thử nội độc tố không thích hợp với một số loại mẫu thử như nhũ dịch, hỗn dịch,…một số chất có thể cho phản ứng dương tính hoặc âm tính giả với thuốc thử lysate như các chế phẩm từ máu, polynucleotide, chế phẩm có chứa kim loại nặng, chất diện hoạt, nồng độ ion cao. Khi trong mẫu thử có chất ức chế hoặc tăng cường với hoạt động của LAL. Cách hữu hiệu nhất để vượt qua được là pha loãng mẫu, xử lý nhiệt, trung hòa pH….

Phương pháp xác định nội độc tố bằng hệ thống Endosafe của hãng Charles River được phê duyệt của FDA, Hoa Kỳ đang được sử dụng tại Bệnh viện Vinmec

Dựa trên chiêu thức đo màu, Charles River, Mỹ đã nâng cấp cải tiến giải pháp so màu động học thành dạng thẻ, xét nghiệm nội độc tố chỉ trong vòng 30 phút, tương thích với những liệu pháp tế bào mà mẫu cần được ghép cho bệnh nhân trong thời hạn ngắn sau giải quyết và xử lý hoặc thu hoạch. Ưu điểm về thời hạn có được nhờ đường cong chuẩn được thiết kế xây dựng và tích hợp sẵn trong mạng lưới hệ thống máy endosafe .

Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Times City đang thực hiện xét nghiệm nội độc tố theo phương pháp đo màu động học sử dụng hệ thống máy xét nghiệm nội độc tố Endosafe của hãng Charles River, Mỹ. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới hiện nay bởi nhiều ưu điểm:

• Độ nhạy rất cao
• Đặc hiệu đối với nội độc tố
• Cho kết quả nhanh chóng chỉ trong 30 phút, đáp ứng được nhu cầu cần trả kết quả gấp.
• Thẻ sử dụng có chứng nhận của FDA, dải thẻ phát hiện nội độc tố có độ nhạy cao từ 0.5 – 0.005 EU/ml.

Trung tâm Công nghệ Cao, Bệnh viện Vinmec cũng là một trong 2 cơ sở của Nước Ta nhận được chứng từ ISO 15189 cho xét nghiệm xác lập nồng độ nội độc tố vi trùng sử dụng mạng lưới hệ thống Endosafe của hãng Charles River. Tiêu chuẩn quản trị chất lượng xét nghiệm ISO 15189 : 2012 là bộ tiêu chuẩn lao lý những nhu yếu về chất lượng so với những phòng xét nghiệm y tế đã được quốc tế công nhận. Bộ tiêu chuẩn gồm 15 nhu yếu về quản trị và 10 nhu yếu kỹ thuật bảo vệ chất lượng trong hoạt động giải trí xét nghiệm như : năng lượng, kiến thức và kỹ năng của cán bộ xét nghiệm ; trấn áp điều kiện kèm theo thiên nhiên và môi trường ; trấn áp thiết bị xét nghiệm ; công tác làm việc sẵn sàng chuẩn bị trước khi xét nghiệm ; trấn áp quy trình thực thi xét nghiệm … Việc vận dụng tiêu chuẩn ISO 15189 sẽ giúp bảo vệ phân phối hiệu quả xét nghiệm một cách đúng mực, kịp thời và đáng tin cậy, làm cơ sở để thôi thúc việc thừa nhận tác dụng xét nghiệm giữa những cơ sở khám và điều trị bệnh nhân. Với việc sử dụng giải pháp xét nghiệm được phê duyệt bởi FDA và đạt chứng từ ISO 15189 : 2012, Vinmec cam kết mang tới quá trình điều trị sử dụng liệu pháp tế bào bảo đảm an toàn nhất tới người bệnh .

Để được tư vấn trực tiếp, Quý Khách vui lòng bấm số (phím 0 để gọi Vinmec) hoặc đăng ký lịch khám tại viện TẠI ĐÂY. Nếu có nhu cầu tư vấn sức khỏe từ xa cùng bác sĩ Vinmec, quý khách đặt lịch tư vấn TẠI ĐÂY. Tải ứng dụng độc quyền MyVinmec để đặt lịch nhanh hơn, theo dõi lịch tiện lợi hơn

Tài liệu tham khảo:

1. USP, Chapter , Bacterial endotoxin test, 161-167, U.S.Pharmacopeial convention, Rockville, MD,2015.
2. USP 39, Chapter , Medical devices- bacterial endotoxin and pyrogen test, 219-222, U>S>Pharmacopeial convention, Rockville,MD, 2016.
3. FDA, guideline on validation of the limulus amebocyte lysate test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices, 1987.
4. Endotoxin limits for parenteral drug products, Bet white paper vol.1 no.2, 2017
5. The Code of Federal Regulations, 21 CFR 211.167
6. Dược điển Việt Nam, Phép thử nội độc tố Phụ lục 13.2
7. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Timothy J. Joiner Paul F. Kraus Thomas C. Kupiec, PhD Analytical Research Laboratories, Oklahoma City, Oklahoma. International Journal of Pharmaceutical Compounding Vol. 6 No. 6 November/December 2002